??RNA測(cè)序(RNA-seq)自誕生起就應(yīng)用于分子生物學(xué)，幫助理解各個(gè)層面的基因功能。RNA-seq中most commonly used分析方法就是找出差異基因表達(dá)(Differential gene expression, DGE)，進(jìn)而根據(jù)差異基因探索生物學(xué)意義或研究靶點(diǎn)。DGE分析的從未發(fā)生實(shí)質(zhì)性的改變，其標(biāo)準(zhǔn)流程分為三步：

??提取RNA，富集mRNA或消除rRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA和構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。

??然后在高通量平臺(tái)(通常是Illumina)上進(jìn)行測(cè)序，每個(gè)樣本測(cè)序reads深度為20-40 Million reads。

??比對(duì)/拼裝測(cè)序reads到轉(zhuǎn)錄本上，對(duì)比對(duì)上的reads定量，樣本標(biāo)準(zhǔn)化，樣本組間基因/轉(zhuǎn)錄本統(tǒng)計(jì)差異分析。

??RNA-seq的應(yīng)用和進(jìn)步是由技術(shù)發(fā)展驅(qū)動(dòng)的，相對(duì)于以前的基因芯片，RNA-seq這種方法產(chǎn)生更豐富并且偏見(jiàn)更小的信息。到目前為止，從標(biāo)準(zhǔn)的RNA-seq方法衍生而來(lái)的各種RNA-seq方法幾乎有100種。Illumina的短讀長(zhǎng)(short-read)測(cè)序平臺(tái)能對(duì)這些由大部分不同方法的RNA-seq構(gòu)建的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，但是most近長(zhǎng)讀長(zhǎng)(longread)RNA-seq的進(jìn)步已經(jīng)能夠解決以前研究人員使用短序列手段無(wú)法解決的一些問(wèn)題，比如更準(zhǔn)確的基因結(jié)構(gòu)研究。

??由于Illumina的短序列讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)生成了SRA(Short Read Archive)中95%已表達(dá)的數(shù)據(jù)，而且cDNA的短序列讀長(zhǎng)測(cè)序方法是一種常規(guī)的方法，故先來(lái)討論這種測(cè)序方式主要流程與局限。

??1. Illumina技術(shù)原理

??Illumina測(cè)序技術(shù)基于橋式擴(kuò)增和同步測(cè)序原理。首先，cDNA被酶切成小片段，接著每個(gè)DNA片段都會(huì)被復(fù)制形成一個(gè)橋，橋上的DNA被定向固定，然后通過(guò)引入熒光標(biāo)記的核苷酸依次進(jìn)行鏈延伸，每次加入一個(gè)核苷酸都會(huì)釋放熒光信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)不同熒光信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)確定具體的堿基序列。 視頻鏈接：Illumina測(cè)序技術(shù)原理 注意：測(cè)序在建庫(kù)之后

??2. Illumina優(yōu)勢(shì)與局限

??優(yōu)勢(shì)：

高通量:Illumina平臺(tái)可以在單次測(cè)序中產(chǎn)生數(shù)十億個(gè)讀長(zhǎng)短的測(cè)序數(shù)據(jù),大程度提高了測(cè)序效率。 

高精度:Illumina采用的測(cè)序化學(xué)和光學(xué)檢測(cè)技術(shù),可以實(shí)現(xiàn)較高的堿基測(cè)序準(zhǔn)確率,通常堿基錯(cuò)誤率低于1%。 

成本低廉:隨著技術(shù)的進(jìn)步,Illumina測(cè)序的成本已大幅下降,使得大規(guī)模測(cè)序項(xiàng)目更加經(jīng)濟(jì)可行。 

廣泛應(yīng)用:Illumina平臺(tái)廣泛應(yīng)用于基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、表觀遺傳學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。

??局限：

讀長(zhǎng)較短:Illumina測(cè)序的讀長(zhǎng)一般在50-300bp之間,相對(duì)較短,在比如可變剪接中可能存在局限性。

• 超過(guò)90%的人類基因存在可變剪接，它們會(huì)形成兩個(gè)或更多的可表達(dá)異構(gòu)體(轉(zhuǎn)錄本x與y)。

• 短讀長(zhǎng)cDNA測(cè)序中增加了捕獲信息的復(fù)雜性，短讀長(zhǎng)對(duì)異構(gòu)體的檢測(cè)會(huì)受到其讀長(zhǎng)的限制，從而無(wú)法精確地回貼到轉(zhuǎn)錄組上，而長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序方法則能直接鑒定異構(gòu)體。

• 在短讀長(zhǎng)cDNA測(cè)序中，有很大比例的讀長(zhǎng)會(huì)不明確地回貼到不同異構(gòu)相同的外顯子上;而那些跨越了外顯子-外顯子連接處的讀長(zhǎng)可以提高對(duì)異構(gòu)體的分析效果，但是當(dāng)不同的異構(gòu)體都含有這個(gè)連接處時(shí)，這種操作意義不大。這些問(wèn)題都加劇了數(shù)據(jù)分析的復(fù)雜性，以及無(wú)法對(duì)結(jié)果進(jìn)行明確地解釋。

耗時(shí)較長(zhǎng):從樣品準(zhǔn)備到數(shù)據(jù)分析,Illumina測(cè)序整個(gè)流程需要較長(zhǎng)的時(shí)間,不適合快速檢測(cè)。

??綜上所述：如果研究方向只是對(duì)差異基因感興趣，則Illumina二代測(cè)序成本較低，測(cè)得的數(shù)據(jù)質(zhì)量也高，是較好的選擇;而如果研究方向是RNA結(jié)構(gòu)方向則需要考慮是否采用三代長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)。

??3. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

??好的RNA-seq實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)獲取高質(zhì)量和有生物意義的數(shù)據(jù)是至關(guān)重要的。特別需要考慮的是生物重復(fù)的數(shù)目、測(cè)序深度、以及批次效應(yīng)。 實(shí)驗(yàn)中必須包含足夠的生物學(xué)重復(fù)以捕獲組內(nèi)樣品自身存在的生物差異。定量分析的可信度更多地取決于生物重復(fù)，而非測(cè)序深度或reads長(zhǎng)度。一般來(lái)說(shuō)至少要大于每組至少要大于三個(gè)樣本，更好達(dá)到6個(gè)樣本以上。 此外，批次效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致差異分析的結(jié)果導(dǎo)致不可信，也就是無(wú)法區(qū)分差異來(lái)自生物學(xué)差異還是因?yàn)榕尾煌瑢?dǎo)致的差異。 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如 first個(gè)批次：2個(gè)control，2個(gè)experiment 第二個(gè)批次：3個(gè)control，3個(gè)experiment 可以通過(guò)算法去除部分批次效應(yīng)

但是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是： first個(gè)批次：3個(gè)control 第二個(gè)批次：3個(gè)experiment 則無(wú)法通過(guò)算法去除部分批次效應(yīng)，此外也無(wú)法區(qū)分差異來(lái)自生物學(xué)差異還是因?yàn)榕尾煌瑢?dǎo)致的差異。

??4. 數(shù)據(jù)分析

??拿到reads的counts數(shù)據(jù)，首先需要對(duì)樣本進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，其次進(jìn)行數(shù)據(jù)探索性分析，接著對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，進(jìn)而對(duì)差異基因進(jìn)行生物學(xué)意義探索

??4.1 樣本標(biāo)準(zhǔn)化

??由于測(cè)序深度越深，在同一水平上表達(dá)的基因reads就會(huì)越多，導(dǎo)致樣本之間不可比，基因越長(zhǎng)，相同水平的reads會(huì)越多，樣本內(nèi)不可比。所以需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，現(xiàn)有FPKM和TPM兩種方式皆可，TPM相對(duì)在二代測(cè)序中使用較多。

??4.2 數(shù)據(jù)探索性分析

??樣本層面的質(zhì)控，可以通過(guò)箱型圖、樣本hclust圖、PCA圖等等，來(lái)確定我們不同樣本間確實(shí)是有差異的!

??箱型圖

??為何在做差異分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)組和組之間存在著明顯的生物學(xué)差異，但箱式圖中卻沒(méi)有表現(xiàn)出來(lái)呢? 這是因?yàn)榛谇疤峒僭O(shè)：大多數(shù)情況下發(fā)生差異表達(dá)的基因只占整體基因的一小部分，不足以改變整體所有基因表達(dá)水平的分布; 如果發(fā)現(xiàn)樣本的總體表達(dá)分布差異較大的情況，往往說(shuō)明不是由于生物水平差異導(dǎo)致的，是批次效應(yīng)導(dǎo)致的; 而只有一個(gè)樣本表達(dá)分布差異較大，則可能是離群樣本，可以考慮刪除。

??樣本聚類圖

??PCA圖

??樣本聚類圖、PCA圖等圖都可以看出組間聚集趨勢(shì)，如沒(méi)有批次效應(yīng)，組內(nèi)樣本聚集在一起為更好。

??4.3 差異分析

??目前差異基因分析主要分為三個(gè)包DESeq2、edgeR、limma，每個(gè)包的前提假設(shè)均不相同， 差異基因也不盡相同，可以自行搜索其區(qū)別，常用的是DESeq2。

??此外，也有學(xué)者認(rèn)為大樣本下(每組8個(gè)樣本及以上)可以直接使用t或者wilcox檢驗(yàn) 鏈接https://doi.org/10.1186/s13059-022-02648-4

??火山圖

??差異基因熱圖

??4.4 富集分析

??基因富集分析(gene set enrichment analysis)是在一組基因或蛋白中找到一類過(guò)表達(dá)的基因或蛋白。一般是高通量實(shí)驗(yàn)，如基因芯片，RNA-Seq，蛋白質(zhì)組學(xué)(質(zhì)譜結(jié)果)的后續(xù)步驟。 基因富集分析需要我們提供某一類功能基因的collection用于背景，常用的注釋數(shù)據(jù)庫(kù)如：

??The Gene Ontology Consortium: 描述基因的層級(jí)關(guān)系

??Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes: 提供了pathway的數(shù)據(jù)庫(kù)。 

      轉(zhuǎn)錄組常見(jiàn)的富集分析有ORA富集分析與GSEA富集分析：

??1. ORA富集分析 通過(guò)對(duì)差異基因進(jìn)行GO分析與KEGG分析

??2. GSEA富集分析 一般的差異分析(GO和KEGG)相對(duì)側(cè)重于比較兩組間的基因表達(dá)差異，集中關(guān)注少數(shù)幾個(gè)明顯上調(diào)或下調(diào)的基因，這容易遺漏部分差異表達(dá)不明顯卻有重要生物學(xué)意義的基因，忽略一些基因的生物特性、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間的關(guān)系及基因功能和意義等有價(jià)值的信息。而GSEA不需要指定明確的差異基因閾值，算法會(huì)根據(jù)實(shí)際數(shù)據(jù)的整體趨勢(shì)， 為研究者們提供了一種合理地解決目前芯片分析瓶頸問(wèn)題的方法,即使在沒(méi)有先驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)存在的情況下也能在表達(dá)譜整體層次上對(duì)數(shù)條基因進(jìn)行分析,從而從數(shù)理統(tǒng)計(jì)上把表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)與生物學(xué)意義很好地銜接起來(lái),使得研究者們能夠更輕松、更合理地解讀芯片結(jié)果

??5. 研究方向與案例展示

??1. 與其他組學(xué)聯(lián)合 Transcriptomic and metabolomic analysis reveals a protein module involved in preharvest apple peel browning

??簡(jiǎn)介：研究采用整合的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)蘋果果皮收獲前褐變主要是由于苯酚類和類黃酮化合物的變化。詳細(xì)分析確定了MdLAC7在蘋果收獲前果皮褐變過(guò)程中的作用

??2. 輔助疾病預(yù)后預(yù)測(cè) Gene signature for the prediction of the trajectories of sepsis-induced acute kidneyinjury

??簡(jiǎn)介：納入2020年11月至2021年12月參與中國(guó)多組學(xué)進(jìn)展在敗血癥(CMAISE)中心收治的敗血癥患者進(jìn)行研究,并在第1天測(cè)量外周血單核細(xì)胞的基因表達(dá)。通過(guò)SOFA評(píng)分的腎功能組分(SOFA腎)在第1天和第3天測(cè)量腎功能軌跡。比較這些腎功能軌跡在第1天的轉(zhuǎn)錄組情況,開(kāi)發(fā)了一個(gè)支持向量機(jī)(SVM)模型,以區(qū)分短暫性AKI和持續(xù)性AKI。

??3. 探索機(jī)制 Targeting adipocytic discoidin domain receptor 2 impedes fat gain while increasing bonemass

??簡(jiǎn)介：肥胖與因骨量輕導(dǎo)致的疾病密切相關(guān)。尋找一個(gè)既能調(diào)節(jié)脂肪代謝又能調(diào)節(jié)骨量的treatment靶點(diǎn)具有重要意義。盤狀結(jié)構(gòu)域受體2(Ddr2)在骨骼代謝和脂肪代謝具有重要作用，但其調(diào)控機(jī)制仍不清晰。本文主要目的是解析Ddr2在肥胖和骨量低之間的調(diào)控機(jī)制，以及靶向Ddr2療法是否可以成為treatment肥胖和骨量輕疾病的潛在策略

??一、 項(xiàng)目介紹

??轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究對(duì)象為特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA的總和，主要包括mRNA和非編碼RNA。轉(zhuǎn)錄組研究是以基因功能及結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn)，通過(guò)高通量測(cè)序，能夠全方面快速地獲得某一物種特定組織或organ在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息，已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷和藥物研發(fā)、植物候選基因發(fā)掘、功能鑒定及遺傳改良等領(lǐng)域。

??二、 項(xiàng)目?jī)?nèi)容

??真核有參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)是針對(duì)有參考基因組的物種，通過(guò)二代測(cè)序平臺(tái)，快速全方面獲得動(dòng)植物特定細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)錄本及基因表達(dá)信息，可進(jìn)行基因表達(dá)水平、基因功能、可變剪切、SNP以及新轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)等方面的研究。該項(xiàng)目能夠從整體水平研究基因表達(dá)差異及功能通路變化，揭示特定生物學(xué)過(guò)程的分子機(jī)制，為動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育、表型性狀、逆境脅迫和抗病機(jī)制等的重要研究手段。

??三、 送樣要求

       參考文獻(xiàn)

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??2. Wang, Hui et al. “Transcriptomic and Metabolomic Analysis Reveals a Protein Module Involved in Pre

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??acute kidney injury. Crit Care 26, 398 (2022).

??4. Yang, X., Li, J., Zhao, L. et al. Targeting adipocytic discoidin domain receptor 2 impedes fat gain while

??increasing bone mass. Cell Death Differ 29, 737–749 (2022).