一、什么是單細胞轉錄組？

繼下一代測序技術(NGS)出現后,測量RNA的高通量方法迅速發展,通常被稱為bulk RNA_seq技術,常用于研究control/diseased之間的轉錄組差異,推動了研究正常生物過程和疾病的方法發生革新性變化。然而,bulk RNA_seq方法存在一個主要局限性:只能估計每個基因在細胞群中的平均表達水平，無法考慮該樣本中單個細胞基因表達的異質性，忽略了細胞間基因表達調控的差異性。隨著2009年湯富酬老師首先開發單細胞轉錄組技術后，單細胞轉錄組技術如雨后春筍般涌現出來，比如Smart-seq、CEL-Seq、Quartz-Seq、Drop-seq、InDrop-seq、Smart-seq2等等。單細胞轉錄組技術的出現使得我們可以把研究的精度從組織多細胞層面精確到單個細胞領域，可以單獨研究某個細胞或者某群細胞具體的特征，進而發現新的或稀有的細胞類型，識別 control/diseased組織之間的差異細胞組成或了解發育過程中的細胞分化，不只如此，還在細胞發育、tumor微環境、單細胞圖譜繪制方面發揮了關鍵作用。

單細胞轉錄組的平臺有很多，常用的有10xGenomics、BD（華大），其中10xGenomics市場占有率更高，因此主要介紹基于10xGenomics單細胞轉錄組平臺數據分析以及注意事項。

二、為什么要進行單細胞轉錄組研究？

1、傳統的轉錄組研究通?；诨旌系募毎后w，得到的是平均的基因表達水平，無法揭示細胞群體中的異質性。單細胞轉錄組技術可以對每個單獨細胞進行分析，揭示不同細胞類型或亞群體之間的差異。

2. 在混合細胞群體中，某些稀有細胞類型的基因表達信號可能被掩蓋。單細胞轉錄組技術能夠識別和分析這些稀有細胞類型，提供更全方面的細胞群體信息。

3. 單細胞轉錄組技術可以揭示細胞在不同發育階段或不同條件下的狀態變化。例如，在研究細胞分化過程時，可以追蹤每個細胞從祖細胞到成熟細胞的轉變路徑，揭示細胞分化的動態過程。

4. 單細胞轉錄組技術在cancer、免疫疾病等領域有廣泛應用。它可以揭示tumor微環境中不同細胞類型的相互作用，識別疾病相關的細胞亞群，幫助理解疾病的發生和發展機制，從而推動精細醫療的發展。

5. 通過單細胞轉錄組技術，可以分析不同細胞類型對藥物的反應，識別出對藥物敏感或耐藥的細胞亞群，幫助優化藥物treatment方案。

三、如何實現單細胞轉錄組測序？

基于標簽（barcode）的單細胞識別。中心思想是：在對每個細胞的mRNA測序前做逆轉錄時，為其加上單獨的標簽序列。這樣即便是混合起來測序，也可以把攜帶相同標簽序列（barcode）的RN**段視為來自同一個細胞。通過這種策略，可以通過一次建庫，測得上萬個單細胞的信息（如下圖所示）。但是要實現單細胞轉錄組測序，需要解決以下2個難題

 1.PCR偏差：單個細胞含有約10pg total RNA，而約80%以上信息為rRNA，從單細胞RNA到文庫意味著核酸的擴增量要達到百萬倍以上。而在這個高的擴增量不引入PCR偏差一直是個較大的問題?？梢韵胍幌?，如果兩個樣本基因表達量是相同的，但擴增效率A是99%，B是97%，在擴增30個循環后，兩者在擴增后的表達就有了1.84倍的差異。而當我們分析差異基因的時候如果選1.5倍作為差異基因的標準，那么本來沒有差異的基因也會出現差異。

 2.去除rRNA：rRNA（核糖體RNA）在total RNA占比一般在80%以上，如果不加區分地進行逆轉錄，再擴增、建庫很可能測序得到的絕大部分序列是rRNA的序列，但是一般情況下，如果你更關心mRNA等編碼基因的序列，rRNA序列不能給我們帶來有效的信息，可以說它是無用的。

四、技術原理

(1)形成GEMs：基于微流控芯片形成油包水（GEMs），每個油包水內含有一個細胞、一個gel bead以及逆轉錄需要的引物試劑和酶等，單個GEM內可進行單獨逆轉錄反應互不干擾。

(2)標記細胞和RNA分子 Gel bead上帶有標簽，GEMs進行逆轉錄，可將10× barcode（10× BC，用來標記細胞)、UMI（標記本底RNA進行定量）加在每個mRNA分子上。

實驗流程：

五、數據分析

經過測序且對原始數據處理后得到的是一個稀疏表達矩陣，行為基因，列為細胞，其實就是每個細胞所有的基因表達情況。后續10xGenomics單細胞轉錄組的分析幾乎都是基于上述方式得到的表達矩陣進行分析的，單細胞轉錄組研究的本質就是研究我們捕獲細胞的的異質性，也就是研究細胞與細胞之間具體有什么差異，細胞與細胞之間有什么聯系，故而單細胞分析的中心就是如何確定樣本中細胞的類型。目前常用的分析R包是 Seurat，官網有著詳細的代碼示例。

1.單細胞轉錄組表達矩陣的獲取

10xGenomics單細胞轉錄組表達矩陣一般是通過cellranger軟件獲取，cellranger為10xGenomics官方分析軟件，有詳細的文檔說明。

2.質控與過濾

中心目的：去掉各種各樣的低質量的細胞。

1. 什么是低質量的細胞？

• 一些即將死亡的細胞（明顯表現在線粒體基因過高且基因數量較少） 

• 測序技術的原因，一個孔內包含了兩個或多個細胞，這種情況下，我們測得的細胞的基因表達量將會異常地高。正常細胞的基因表達量通常在3000-4000左右。

2. 常見的處理：

• 刪除高于一定閾值基因數的細胞，低于一定閾值基因數的細胞，以及線粒體基因比例高于一定閾值的細胞。

根據項目不同閾值有所不同，另外更好根據圖形進行判斷。https://www.nature.com/articles/s41467-023-42911-1 （可以查看該論文的詳細處理過程)

3. 可視化

• 用小提琴圖探索一下特征的分布情況

• 利用散點圖，看一下不同變量間的相關性

• 定義過濾條件，將質量差、非單細胞的數據剔除掉，再用小提琴圖查看一下特征的分布情況

3. 數據歸一化、尋找高變基因與標準化

(1)為什么需要對數據進行處理？

由于實驗和測序步驟都具有隨機性，即便是同一細胞在兩次捕獲測序中得到的深度也不一定相同，因此直接比較原始表達計數得到的差異可能是由于技術偏差造成。 表達矩陣標準化通過對count數進行調整，使獲得具有可比性的相對表達豐度。 數據處理的目的：

● 使細胞間表達具有可比性

● 使表達量分布符合統計學分布

(2)如何對數據進行處理？

a.數據標準化 most常用的方法是針對測序深度進行標準化，使每個細胞具有相同的reads數據量 Seurat默認的標準化方法為 LogNormalize ： 以e為底數，log（每個細胞中基因的nCount_RNA /該細胞內總Count*10000 + 1）

b.篩選高變基因 對于一個給定的單細胞數據集，其中有許多基因都不能提供有用信息，并且大多只包含零計數。即使在QC步驟中濾除了這些零計數基因后，單細胞數據集也可能超過15,000個基因； 為了減輕下游分析工具的計算負擔、減少數據中的噪聲并方便數據可視化，可對數據集基因進行過濾只保留對數據的變異性具有信息貢獻的基因（變化程度大）； 高變基因：在表達矩陣中表達變化大的基因，即在一些細胞中高表達，在另外一些細胞中低表達； 一般使用均值與方差之間的關系來挑選高變基因： Seurat默認的標準化方法為vst：首先利用loess回歸對log(variance)和log(mean)擬合一條直線，然后利用觀測均值和期望方差對基因表達量進行標準化，final根據標準化后的表達量計算方差；

c.數據歸一化 對表達矩陣進行scale處理，scale之后的矩陣每個基因表達均值為0 經過scale之后，所有基因的表達分布基本一致，有助于后續的降維聚類

4. 降維與初步聚類、查看是否有批次效應

單細胞RNA測序（scRNA-seq）是一種高通量測序技術，它產生的數據集在細胞和基因數量上都具有很高的維度。這立即指向了一個事實，即單細胞RNA測序數據受到了"維度詛咒"的困擾，更高維度的數據往往包含更多的噪聲和冗余，因此增加更多的信息并不利于后續的分析步驟。

• 常見的降維方式：PCA、t-SNE、UMAP

1. 具體流程

(1)首先對數據進行PCA降維單細胞

(2)其次進行t-SNE、UMAP

(3)觀察t-SNE、UMAP的樣本或分組分布是否相似判斷是否有批次效應

(4)利用harmony對批次效應進行處理

5. 聚類與market注釋

基于去除批次效應的數據重新聚類，并進行market注釋

• market注釋

通過聚類好的細胞簇，讓某一細胞簇和其他細胞簇進行差異基因分析，進而通過差異基因注釋

常用的注釋網站CellMarker

6. 細胞比例的分布

一般多組多樣本的情況下除了關注基因表達模式受不同條件所影響導致的改變，還會關注細胞組成（例如細胞類型的比例）在不同條件下發生變化。

7. 針對不同細胞類型進行差異分析富集分析等等

通過上面的注釋對不同分組下感興趣的細胞類型進行差異分析，與Bulk RNA相似，進而可以做富集分析、GSEA、GSVA。 注：以上是研究細胞與細胞之間具體有什么差異的標準流程，而細胞與細胞之間有什么聯系則一般是高級分析的細胞通訊、擬時序分析。

六、單細胞轉錄組的應用

(1)圖譜性研究：A pan-cancer single-cell tranional atlas of tumor infiltrating myeloid cells

(2)發育分化方向：Molecular architecture of the developing mouse brain

(3)細胞周期方向：An alternative cell cycle coordinates multiciliated cell differentiation

(4)treatment：Progenitor-like exhausted SPRY1+CD8+ T cells potentiate responsiveness to neoadjuvant PD-1blockade in esophageal squamous cell carcinoma

七、送樣要求

參考文獻

1. Jovic D, Liang X, Zeng H, Lin L, Xu F, Luo Y. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: Abrief overview. Clin Transl Med. 2022 Mar;12(3):e694. doi: 10.1002/ctm2.694. PMID: 35352511; PMCID: PMC8964935.

2. Heumos, L., Schaar, A.C., Lance, C. et al. Best practices for single-cell analysis across modalities. Nat RevGenet 24,550–572(2023).https://doi.org/10.1038/s41576-023-00586-w

3. Cheng S, Li Z, Gao R, Xing B, Gao Y, Yang Y, Qin S, Zhang L, Ouyang H, Du P, Jiang L, Zhang B, Yang Y,Wang X, Ren X, Bei JX, Hu X, Bu Z, Ji J, Zhang Z. A pan-cancer single-cell transcriptional atlas of tumor infiltrating myeloid cells. Cell. 2021 Feb 4;184(3):792-809.e23. doi: 10.1016/j.cell.2021.01.010. PMID: 33545035.

4. Choksi, S.P., Byrnes, L.E., Konjikusic, M.J. et al. An alternative cell cycle coordinates multiciliated celldifferentiation.Nature(2024).https://doi.org/10.1038/s41586-024-07476-z

5. La Manno, G., Siletti, K., Furlan, A. et al. Molecular architecture of the developing mouse brain. Nature596, 92–96 (2021). https://doi.org/10.1038/s41586-021-03775-x

6. Liu Z, Zhang Y, Ma N, Yang Y, Ma Y, Wang F, Wang Y, Wei J, Chen H, Tartarone A, Velotta JB, Dayyani F,Gabriel E, Wakefield CJ, Kidane B, Carbonelli C, Long L, Liu Z, Su J, Li Z. Progenitor-like exhausted SPRY1+CD8+ T cells potentiate responsiveness to neoadjuvant PD-1 blockade in esophageal squamous cell carcinoma. CancerCell.2023Nov13;41(11):1852-1870.e9. doi: 10.1016/j.ccell.2023.09.011. Epub 2023 Oct 12. PMID: 37832554.