【技術(shù)原理】

??DNA甲基化(DNA methylation)是一種關(guān)鍵的表觀遺傳學(xué)機制，通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在二核苷酸的胞嘧啶C-5位添加一個甲基基團，引起不同基因的轉(zhuǎn)錄刺激或抑制，并調(diào)節(jié)各種細胞功能。這種DNA化學(xué)修飾可以在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)。DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達。細胞 DNA 甲基化狀態(tài)的變化與衰老，發(fā)育和疾病病理有關(guān)。

??Infinium MethylationEPIC v2.0 BeadChip Kit(935K)是一種全基因組甲基化篩選工具，靶向人類甲基化組具生物學(xué)意義的區(qū)域中超過 935,000 個 CpG 位點，同時在其前代產(chǎn)品MethylationEPIC v1.0(850k)的基礎(chǔ)上極大的提高了向后兼容性。該芯片保留了以單核苷酸分辨率定量分析全基因組 CpG 的能力，同時提供高度準確和精確的甲基化測量，不受測序深度的影響。可使用精簡、用戶友好的 Infinium 甲基化檢測分析多種 DNA 樣本類型，包括從 FFPE 分離的 DNA 樣本。與其他方法相比，MethylationEPIC v2.0 具有可擴展性和更低的單個樣本總成本，因此可用于探究疾病機制和生物標志物的篩選。

【技術(shù)優(yōu)勢】

??MethylationEPIC BeadChip兼具全方面的覆蓋范圍和高通量功能，因此是全表觀基因組關(guān)聯(lián)研究(EWAS)的理想之選。

??全方面的基因組覆蓋范圍：檢測> 935,000 個 CpG 位點，全方面覆蓋 CpG 島、啟動子、編碼區(qū)及增強子。

??探針位點的全方面優(yōu)化：在 EPICv1.0-850K 的基礎(chǔ)上去除了性能不佳的探針，新增186,000 個 CpG 靶向增強子和超級增強子、更多 CTCF 結(jié)合位點、CNV 檢測區(qū)域、EPIC v1.0 覆蓋不足的 CpG 島以及常見cancer驅(qū)動突變。

??兼容多種樣本類型，包括 FFPE：935K 芯片檢測兼容 FFPE、新鮮/冷凍組織、全血、口腔細胞、cfDNA、唾液和其他樣本類型。FFPE 兼容性對于cancer研究極為重要，能夠支持以大型tumor生物樣本庫為基礎(chǔ)的研究。

??分辨率高：單堿基分辨率，可以直接檢測到發(fā)生甲基化的準確位點。

??高度準確和精確的檢測數(shù)據(jù)：935K 甲基化芯片檢測能夠檢測到 0.2 的 beta 值差異，假陽性率低于 1%，從而實現(xiàn)了較高的分析靈敏度，同時也具有極好的數(shù)據(jù)可重現(xiàn)性。

【研究方向】

??935K 芯片靶向人類基因甲基化組，主要面向醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，可以涉及以下幾個研究方向：

??tumor：肺cancer、食管cancer、膠質(zhì)瘤、白血病等疾病研究和tumor標志物;

??復(fù)雜疾病：自身免疫性疾病、代謝性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、衰老等的研究;

??發(fā)育：胚胎發(fā)育、神經(jīng)分化、organ分化等研究;

??環(huán)境互作：環(huán)境污染、吸煙、孕期暴露等研究。

【案例介紹】

??標題：通過整合DNA甲基化和RNA-Seq數(shù)據(jù)分析鑒定類風濕性關(guān)節(jié)炎中DNA甲基化調(diào)節(jié)的差異表達基因

??期刊：Journal of Translational Medicine

??影響因子：7.4

??研究對象：類風濕性關(guān)節(jié)炎

1、 研究背景

??類風濕性關(guān)節(jié)炎 (RA) 是一種以滑膜炎和系統(tǒng)炎癥為特征的自身免疫性疾病，可影響包括滑膜組織在內(nèi)的許多組織，導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹和疼痛。其發(fā)病機制尚不十分清楚，包括免疫相關(guān)基因的異常表達、免疫相關(guān)通路的activation等。因此，鑒定參與 RA 致病過程的基因和信號通路非常重要。

2、 研究方法

??通過 RNA-Seq 和 Illumina 850K DNA 甲基化 BeadChip 生成 9 個 RA 和 15 個 OA 滑膜組織的轉(zhuǎn)錄和 DNA 甲基化譜。使用基因集富集分析(GSEA)和加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)來分析甲基化調(diào)控的表達基因。通過比較差異表達基因(DEGs)和差異甲基化基因(DMGs)，鑒定甲基化調(diào)節(jié)的差異表達基因(MeDEGs)，分析MeDEGs的功能相關(guān)性，基于MeDEGs構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)并挑選樞紐基因，對關(guān)鍵基因的甲基化水平和mRNA表達量進行相關(guān)性分析。

3、 研究結(jié)果

??在本研究中，在轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中鑒定出 17,736 個基因，在 Illumina 850K BeadChip 數(shù)據(jù)中鑒定出25,578 個甲基化基因，兩組數(shù)據(jù)交叉后，總共獲得了16,421個甲基化調(diào)控的表達基因。

??GSEA 顯示這些基因與免疫反應(yīng)、適應(yīng)性免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的activation相關(guān)。KEGG分析發(fā)現(xiàn)這些基因與類風濕性關(guān)節(jié)炎、NF-κB信號通路、T細胞受體信號通路相關(guān)。 WGCNA顯示turquoise模塊與RA表現(xiàn)出most強的相關(guān)性。

??圖2 RA中差異表達基因和差異甲基化探針

??基于轉(zhuǎn)錄組和甲基化組的差異分析篩選了 851 個 DEGs 和 16,250 個 DMGs，兩者交叉后總共獲得了 707 個 MeDEGs。GO分析顯示，MeDEGs富集于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞粘附、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、質(zhì)膜和膜的組成成分、相同蛋白結(jié)合、鈣離子結(jié)合等功能。KEGG通路分析顯示MeDEGs富集于鈣信號通路、T細胞受體信號通路、NF-κB信號通路、類風濕性關(guān)節(jié)炎等。

??圖3 MeDEGs的GO和KEGG通路分析

??PPI分析篩選出8個與RA相關(guān)的功能模塊。根據(jù)PPI分析和WGCNA分析的結(jié)果，確定SPP1、RGS1、RAC2、MMP3、IL32、CD52、CCL5是其中的樞紐基因。Spearman相關(guān)分析進一步顯示RGS1(cg10718027)、RGS1(cg02586212)、RGS1(cg10861751)與RA明顯相關(guān)。

??圖4 差異甲基化位置/基因的甲基化程度與mRNA的相關(guān)性分析

4、 研究結(jié)論

??本研究通過對轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化組的綜合生物信息學(xué)分析揭示了與 RA 相關(guān)的基因的分子功能。研究結(jié)果表明G 蛋白信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子 1 (RGS1)可作為 RA 的新型甲基化生物標志物，是RA診斷和treatment的潛在靶點。

【實驗流程】

【數(shù)據(jù)分析】

【送樣要求】

1. 細胞樣本(只限于人體細胞)：

2. 組織樣本(只限于人體組織)

3. 血液樣本(只限于人體血液)

4. 其他樣本類型

參考文獻

Zhang, R. et al. Identification of DNA methylation-regulated differentially expressed genes in RA by integrated analysis of DNA methylation and RNA-Seq data. Journal of Translational Medicine 20, doi:10.1186/s12967-022-03664-5 (2022).